एप्रोटीनिन कैस 9087-70-1

एप्रोटीनिन78R2S7, आणविक सूत्र C284H432N84O, CAS 9087-70-1, यह एक प्रोटीज़ अवरोधक है जो ट्रिप्सिन और काइमोट्रिप्सिन को रोक सकता है, अग्न्याशय में अन्य सक्रिय प्रोटीसोम के सक्रियण और ट्रिप्सिनोजेन के स्वयं सक्रियण को रोक सकता है। तीव्र अग्नाशयशोथ, फाइब्रिनोलिसिस के कारण होने वाले रक्तस्राव और प्रसारित इंट्रावास्कुलर जमावट की रोकथाम और उपचार के लिए चिकित्सकीय रूप से उपयोग किया जाता है। इसका उपयोग शॉक रोधी उपचार के लिए भी किया जा सकता है। प्रोटीज़ अवरोधक ऐसे पदार्थ हैं जो एंजाइमों से बंध सकते हैं और सब्सट्रेट क्षरण की दर को कम कर सकते हैं। प्रोटीन गुणों वाले प्रोटीज़ अवरोधक व्यापक रूप से मौजूद हैं, और प्रोटीन गुणों वाले दो प्रकार के प्रोटीज़ अवरोधक सोयाबीन से अलग किए गए हैं: कुनिज़ ट्रिप्सिन अवरोधक और बॉमन बेलक अवरोधक। पहले का आणविक भार 20-25 कू होता है, जबकि दूसरे का आणविक भार 8 कू होता है।

पुनः संयोजकaprotinin(RTI16) किनिनेज और ट्रिप्सिन को रोक सकता है, और एक प्राकृतिक गैर-विशिष्ट सेरीन प्रोटीज़ अवरोधक है। यह 58 अमीनो एसिड अवशेषों से बना एक एकल श्रृंखला मूल प्रोटीन है, जिसमें 3 डाइसल्फ़ाइड बांड श्रृंखला में जुड़े हुए हैं। लंबे समय से, एप्रोटिन का उपयोग तीव्र अग्नाशयशोथ के उपचार के लिए किया जाता रहा है। 1990 के दशक के बाद, प्लेटलेट्स की सुरक्षा, रक्तस्राव और स्राव को कम करने और जमावट विकारों वाले रोगियों के नैदानिक ​​उपचार के लिए कार्डियोथोरेसिक सर्जरी में पुनः संयोजक एप्रोटिन का उपयोग किया जाने लगा। इसलिए, एप्रोटिन का बाजार आकार तेजी से बढ़ा है और महत्वपूर्ण जैव रासायनिक दवाओं में से एक बन गया है।

संश्लेषण

 

वर्तमान में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पुनः संयोजक एप्रोटिन तैयारी मुख्य रूप से गोजातीय फेफड़ों जैसे अंगों से निकाले गए अर्क हैं, जिनमें जटिल प्रक्रियाएं और उच्च लागत होती है। इसलिए, आनुवंशिक इंजीनियरिंग विधियों का उपयोग करके पुनः संयोजक एप्रोटीन के उत्पादन का पता लगाना बहुत महत्वपूर्ण है।

स्राव अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करते समय, एप्रोटिन का उत्पादन आम तौर पर कम होता है, और परिणामी उत्पाद की गतिविधि भी कम होती है। संलयन अभिव्यक्ति के माध्यम से, पुनः संयोजक एप्रोटिन के अभिव्यक्ति स्तर में काफी वृद्धि होने की उम्मीद है।

 

इस उद्देश्य के लिए एक पुनः संयोजक एप्रोटिन एक्सप्रेशन प्लास्मिड पीजीआरएक्सए बीपीटीआई का निर्माण किया गया था, और एफएक्सए के लिए एक मान्यता साइट फ्यूजन पार्टनर और पुनः संयोजक एप्रोटिन के बीच डिजाइन की गई थी। समावेशन निकाय के रूप में व्यक्त होने के बाद, फ़्यूज़न पार्टनर को जेल निस्पंदन द्वारा शुद्ध और पुन: मोड़ दिया गया। प्राकृतिक उत्पाद के समान गतिविधि वाला प्रोटीन प्राप्त करने के लिए फ़्यूज़न पार्टनर को एफएक्सए द्वारा उत्पादित किया गया था। अभिव्यक्ति स्थितियों के अनुकूलन के माध्यम से, पिछले अभिव्यक्ति प्रणालियों की तुलना में उपज में काफी सुधार हुआ था।

इंजीनियरिंग बैक्टीरिया की अभिव्यक्ति का अनुकूलन:

 

एलबी/एएमपी एगर प्लेटों पर ग्लिसरॉल ट्यूब बैक्टीरिया का टीका लगाएं, 20 घंटे के लिए 37 डिग्री पर कल्चर करें, कॉलोनियों को खुरचें और उन्हें 5 एमएल एलबी/एएमपी तरल माध्यम में 37 डिग्री, 200 आर/मिनट पर टीका लगाएं और रात भर कल्चर करें। 5% इनोकुलम को 100 एमएल कॉर्न स्लरी मीडियम में डालें, 37 डिग्री और 220 आर/मिनट पर शेकर पर कल्चर करें, 7 घंटे के लिए प्रेरित करें और फिर बैक्टीरिया कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए सेंट्रीफ्यूज (8000 आर/मिनट, 5 मिनट, 4 डिग्री) करें। जीवाणु कोशिकाओं के गीले वजन को तौलें और 15% एसडीएस-पेज द्वारा उनकी अभिव्यक्ति का पता लगाएं।

किण्वन टैंक खेती

 

किण्वन टैंक खेती:

जर्मन बायोस्टेट 30 एल किण्वन टैंक का उपयोग, 37 डिग्री पर, 20%, पीएच 7.0 पर नियंत्रित घुलनशील ऑक्सीजन के साथ। संलयन प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए एक किण्वन टैंक का उपयोग करके, 16 लीटर किण्वन शोरबा से 260 ग्राम गीले जीवाणु कोशिकाएं प्राप्त की गईं, लगभग 16 ग्राम/लीटर; अभिव्यक्ति का स्तर लगभग 45% है,

दीवार तोड़ना और जीवाणु कोशिकाओं का समावेशन शरीर अधिग्रहण:

 

खेती पूरी होने के बाद, बैक्टीरिया कोशिकाओं को इकट्ठा करें, 10 एमएल घोल ए (50 मिमीओल/एल ट्रिस एचसीएल, पीएच 8.0, 1 मिमीओल/एल ईडीटीए) में 1 ग्राम बैक्टीरिया कोशिकाएं जोड़ें, उन्हें अच्छी तरह से निलंबित करें, कोशिकाओं को बर्फ के स्नान में सोनिकेट करें, 30 सेकंड के लिए काम करें, 10 सेकंड के लिए अंतराल, शक्ति 400 डब्ल्यू, 30 चक्र। तरल को एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, 15 मिनट के लिए 4 डिग्री और 8000 आर/मिनट पर सेंट्रीफ्यूज करें, और अवक्षेप क्रूड समावेशन निकाय है।

समावेशन निकाय विघटन समाधान की तैयारी:

 

कच्चे समावेशन निकाय को घोल B (50 mmol/L ट्रिस HCl, pH 8.0, 1 mmol/L EDTA, 1% ट्राइटन-X100) से दो बार धोएं, हर बार 0.5 घंटे के लिए, सतह पर तैरनेवाला हटाने के लिए अपकेंद्रित्र, और अपेक्षाकृत शुद्ध समावेशन निकाय प्राप्त करें। 5 एमएल घोल सी (50 एमएमओएल/एल ट्रिस एचसीएल, पीएच 8.0, 8 मोल/एल यूरिया, 1 एमएमओएल/एल ईडीटीए, 5 एमएमओएल/एल डीटीटी) में 1 ग्राम समावेशन निकाय जोड़ें, 4 डिग्री पर रात भर इनक्यूबेट करें, विकृत करें और घोलें, 15 मिनट के लिए 12000 आर/मिनट पर सेंट्रीफ्यूज करें, और समावेशन शरीर विघटन समाधान प्राप्त करने के लिए सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करें। पुनः संयोजक एप्रोटिन प्राप्त करें।

औषधीय प्रभाव:

 

 

एप्रोटीनिनएक निश्चित रासायनिक अनुपात में गठित प्रतिवर्ती एंजाइम अवरोधक परिसरों के माध्यम से मानव ट्रिप्सिन, फाइब्रिनोलिटिक एंजाइम, प्लाज्मा और ऊतक एंजियोटेंसिन को रोकता है। सेरीन गतिविधि वाले प्रोटीज वैसोप्रेसिन किनिनोजेन किनिन प्रणाली, पूरक प्रणाली और जमावट प्रणाली में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं, जहां प्लास्मिन और प्लाज्मा वैसोप्रेसिन महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।

 

एप्रोटिन एंजाइम पर सेरीन सक्रिय भाग के माध्यम से एप्रोटिन प्रोटीज़ कॉम्प्लेक्स बनाकर अपना निरोधात्मक प्रभाव डालता है। हालाँकि, जब विभिन्न प्रोटीज के साथ जोड़ा जाता है, तो यह अलग-अलग पृथक्करण स्थिरांक प्रदर्शित करता है। ट्रिप्सिन के साथ बंधन सबसे मजबूत (Ki{2}}nmoN) है, जो प्रोटीन -प्रोटीन इंटरैक्शन (Laydunski et al. 1974) में रिपोर्ट किए गए सबसे कम स्थिरांक में से एक है। मानव फाइब्रिनोलिटिक एंजाइम के साथ बंधन बहुत मजबूत नहीं है। एंजाइम इनहिबिटर कॉम्प्लेक्स (Ki=1 nmoN) के उच्च K मान के कारण, यह प्रतिवर्ती हो सकता है (विमैन, 1980), और मानव प्लाज्मा एंजियोटेंसिन को बांधने वाला कॉम्प्लेक्स काफी कमजोर है (Ki=30 nmol/l), लेकिन फिर भी एप्रोटिन की चिकित्सीय सीमा के भीतर है (नकाहारा, 1983)।

 

एप्रोटिन न केवल मुक्त एंजाइम अणुओं को बांधता है, बल्कि उन एंजाइमों को भी बांधता है जो पहले से ही तीसरे घटक से बंधे हैं (यदि एंजाइम के सक्रिय केंद्र में अभी भी बाध्यकारी क्षमता है)। इसलिए, एप्रोटिन मुक्त फाइब्रिनोलिटिक एंजाइमों को रोकता है और चेन किनेज (विमैन, 1980) के साथ थ्रोम्बोलाइटिक थेरेपी के दौरान बनने वाले मध्यवर्ती फाइब्रिनोलिसिन चेन किनेज कॉम्प्लेक्स को भी रोक सकता है।
एप्रोटिन का एंटी फाइब्रिनोलिटिक प्रभाव प्रोटीन हाइड्रोलिसिस द्वारा सक्रिय प्लास्मिन के निषेध पर आधारित है। सिंथेटिक एंटी फाइब्रिनोलिटिक सॉल्वैंट्स के विपरीत, अतिसक्रिय प्लास्मिन के प्रत्यक्ष निषेध के कारण, एप्रोटिन न केवल प्लास्मिन द्वारा प्रत्यक्ष सब्सट्रेट (फाइब्रिन) को क्षरण से बचाता है, बल्कि प्लाज्मा में फाइब्रिनोजेन, कारक V और VIII और सीरम में अल्फा 2-ग्लोब्युलिन की भी रक्षा करता है।

 

एंडोटॉक्सिन प्रेरित शॉक और हाइपोवोलेमिक शॉक के प्रयोगों में, ट्रैसिलोल किनिनोजेन की सक्रियता को महत्वपूर्ण रूप से रोक सकता है। (मासियन एट ए1．1972)।
ट्रैसिलोल पल्मोनरी इंटरस्टिशियल एडिमा (शॉक लंग) के विकास को रोक या विलंबित कर सकता है। इसका निरोधात्मक प्रभाव खुराक पर निर्भर है और समय पर निर्भर है (लोरथियोइर एट अल., 1973)।
सदमे के दौरान, इस्केमिक अग्न्याशय एक अत्यधिक विषाक्त पेप्टाइड पदार्थ, अर्थात् मायोकार्डियल इनहिबिटरी फैक्टर (एमडीएफ) का उत्पादन कर सकता है। इस कारक का सदमे से मृत्यु से गहरा संबंध है।

 

हेमोरेजिक, सेप्टिक, कार्डियोजेनिक शॉक और बर्न शॉक वाले चूहों, कुत्तों, बंदरों और मनुष्यों के प्लाज्मा में एमडीएफ का पता लगाया जा सकता है। एमडीएफ रक्तस्राव के सभी मामलों में मायोकार्डियल सिकुड़न में कमी का कारण बन सकता है, और साथ ही, यह आंत के प्रतिरोध वाहिकाओं के संकुचन का कारण बनता है, जिससे स्थानीय इस्किमिया और अधिक एमडीएफ का उत्पादन होता है। इसके अलावा, रेटिकुलोएंडोथेलियल सिस्टम को होने वाली विषाक्त क्षति के कारण, रक्तप्रवाह में इसकी निकासी में देरी होती है। ट्रैसिलोल एमडीएफ के उत्पादन को काफी हद तक रोक सकता है (लेफ़र 1984)।

एप्रोटीनिन, एक छोटे अणु यौगिक के रूप में जो फाइब्रिनोलिसिस का प्रतिरोध करता है, महत्वपूर्ण और विशिष्ट एंजाइम निरोधात्मक गुण प्रदर्शित करता है। यह न केवल ट्रिप्सिन की गतिविधि को प्रभावी ढंग से रोकता है, बल्कि अन्य संबंधित प्रोटियोलिटिक एंजाइमों पर भी बड़े पैमाने पर कार्य करता है, इस प्रकार कोशिका जीव विज्ञान प्रयोगों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। विशेष रूप से कोशिका और ऊतक लसीका और समरूपीकरण के दौरान, एप्रोटिन एक कुशल प्रोटीज अवरोधक के रूप में काम कर सकता है, जो लक्ष्य प्रोटीन के आकस्मिक क्षरण को प्रभावी ढंग से रोकता है, जो नमूना अखंडता और सटीकता बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है।

एप्रोटिन का निरोधात्मक प्रभाव एक स्पष्ट खुराक निर्भरता दर्शाता है, अर्थात जैसे-जैसे इसकी एकाग्रता बढ़ती है, फाइब्रिनोलिटिक गतिविधि पर निरोधात्मक प्रभाव भी तदनुसार बढ़ता है। यह सुविधा शोधकर्ताओं को अधिक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रयोगात्मक स्थितियों को अधिक सटीक रूप से नियंत्रित करने में सक्षम बनाती है। इस बीच, एप्रोटिन रक्त के थक्के जमने के समय को भी बढ़ा सकता है, जिससे जमावट तंत्र में इसकी महत्वपूर्ण भूमिका की पुष्टि होती है। इन विट्रो प्रयोगों से पता चला है कि एप्रोटिन एक प्रभावी अंतर्जात जमावट मार्ग अवरोधक है जो जमावट प्रक्रिया में प्रमुख प्रक्रियाओं में हस्तक्षेप और विनियमन कर सकता है।

एप्रोटिनी ने अपने अद्वितीय औषधीय प्रभावों का भी प्रदर्शन किया है। यह इन विट्रो में रक्त के थक्के के विघटन की प्रक्रिया को महत्वपूर्ण रूप से बाधित कर सकता है, चूहों में पूंछ ट्रिमिंग के रक्तस्राव के समय को बढ़ा सकता है, और मानव प्लाज्मा में जमाव के समय को बढ़ा सकता है। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि एप्रोटिन में संभावित रक्तस्राव रोधी और थ्रोम्बोटिक रोधी प्रभाव हो सकते हैं। इसके विवो प्रभाव को और अधिक प्रमाणित करने के लिए, शोधकर्ताओं ने चूहे के धमनीशिरापरक शॉर्ट सर्किट मॉडल में प्रयोग किए। परिणामों से पता चला कि एप्रोटिन रक्त के थक्कों के वजन को काफी कम कर सकता है, और एक एंटीथ्रोम्बोटिक दवा के रूप में इसकी क्षमता का समर्थन करता है।

संक्षेप में, एप्रोटिन, एक छोटे अणु यौगिक के रूप में जो फाइब्रिनोलिसिस को रोकता है, ने इन विट्रो और विवो दोनों में महत्वपूर्ण एंजाइम निरोधात्मक गुणों और औषधीय प्रभावों का प्रदर्शन किया है। कोशिका जीव विज्ञान प्रयोगों में इसका अनुप्रयोग शोधकर्ताओं को शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है, जबकि विवो अध्ययनों में इसके निष्कर्ष एंटी ब्लीडिंग और एंटी थ्रोम्बोटिक दवा के रूप में इसके विकास के लिए महत्वपूर्ण सुराग और आधार प्रदान करते हैं। भविष्य में, एप्रोटिन की क्रिया के तंत्र और नैदानिक ​​​​परीक्षणों पर आगे के शोध के साथ, हमें चिकित्सा क्षेत्र में इसके व्यापक अनुप्रयोग को देखने की उम्मीद है।

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