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जेड-एआरजी-एलईयू-एआरजी-ग्लाइ-ग्लाइ-एएमसी, आणविक सूत्र C40H56N12O9, CAS 167698-69-3। पेप्टाइड के रूप में, पेप्टाइड के रूप में, इसमें पेप्टाइड पदार्थों के सामान्य गुण होने चाहिए। पेप्टाइड्स पेप्टाइड बॉन्ड के माध्यम से अमीनो एसिड को जोड़कर बनने वाले यौगिक हैं और इनमें पानी में घुलनशीलता अच्छी होती है क्योंकि पेप्टाइड श्रृंखला पर ध्रुवीय समूह (जैसे अमीनो और कार्बोक्सिल समूह) पानी के अणुओं के साथ हाइड्रोजन बॉन्ड बना सकते हैं।
इसके अलावा, पेप्टाइड पदार्थों में आमतौर पर उच्च जैविक गतिविधि होती है और वे विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं में भाग ले सकते हैं। जैव रसायन और चिकित्सा अनुसंधान में इसके अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है, जिसमें SARS के लिए पेप्टाइड सब्सट्रेट के रूप में काम करना शामिल है। ये अनुप्रयोग न केवल जैविक प्रक्रियाओं के सार और तंत्र को प्रकट करने में मदद करते हैं, बल्कि दवा विकास और रोग उपचार के लिए नए विचार और तरीके भी प्रदान करते हैं।
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अनुकूलित बोतल के ढक्कन और कॉर्क:
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रासायनिक सूत्र |
C32H51N11O9 |
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सटीक द्रव्यमान |
733 |
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आणविक वजन |
734 |
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m/z |
733 (100.0%), 734 (34.6%), 735 (3.1%), 735 (2.7%), 734 (2.2%), 735 (1.8%), 734 (1.8%), 735 (1.4%) |
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मूल विश्लेषण |
C, 52.38; H, 7.01; N, 21.00; O, 19.62 |
जेड-एआरजी-एलईयू-एआरजी-ग्लाइ-ग्लाइ-एएमसीएक विशिष्ट पेप्टाइड पदार्थ के रूप में, जैव रसायन और चिकित्सा अनुसंधान में इसके अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है।
पहले तो
इसका उपयोग अक्सर SARS के लिए पेप्टाइड सब्सट्रेट के रूप में किया जाता है। SARS-CoV एक कोरोना वायरस है, और इसका PLpro वायरस प्रतिकृति प्रक्रिया में एक प्रमुख एंजाइम है, जो वायरल पॉलिमरिक प्रोटीन के प्रसंस्करण में भाग लेता है। इसलिए, SARS -CoV के प्रतिकृति तंत्र का अध्ययन करने, एंटीवायरल दवाओं की जांच करने और टीका विकास में इसका महत्वपूर्ण अनुप्रयोग मूल्य है।
दूसरे
यह जैविक इमेजिंग और सेल स्थानीयकरण अनुसंधान के लिए एक फ्लोरोसेंट जांच के रूप में भी काम कर सकता है। एएमसी (एमिनो मिथाइल कौमारिन) समूह की उपस्थिति के कारण, यह पेप्टाइड प्रतिदीप्ति गुण प्रदर्शित करता है और उत्तेजना के तहत प्रतिदीप्ति उत्सर्जित कर सकता है। यह कोशिकाओं और ऊतकों में विशिष्ट अणुओं या संरचनाओं की लेबलिंग को सक्षम बनाता है, जिससे जैविक प्रक्रियाओं के गतिशील परिवर्तनों का पता चलता है।
इसके अलावा
इसका उपयोग उच्च थ्रूपुट अवरोधक स्क्रीनिंग और निरंतर विश्लेषण के लिए भी किया जा सकता है। दवा के विकास की प्रक्रिया में, ऐसे यौगिकों को ढूंढना महत्वपूर्ण है जो विशिष्ट एंजाइमों या प्रोटीन की गतिविधि को प्रभावी ढंग से रोक सकते हैं। पीएलप्रो के लिए पेप्टाइड सब्सट्रेट के रूप में, इसका उपयोग संभावित अवरोधकों के साथ मिलकर सब्सट्रेट हाइड्रोलिसिस दर में परिवर्तन को मापकर उनकी गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। इस विधि में उच्च थ्रूपुट, उच्च संवेदनशीलता और उच्च विशिष्टता के फायदे हैं, जो दवा स्क्रीनिंग की प्रक्रिया को काफी तेज कर सकते हैं।
अंत में
इसके अलावा, इसे इम्यूनोलॉजिकल रिसर्च पर भी लागू किया जा सकता है। पेप्टाइड पदार्थ प्रतिरक्षा प्रणाली में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और एंटीजन या एंटीबॉडी के रूप में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में भाग ले सकते हैं। Z{{2}ARG-LEU{{4}ARG-GLY-AMC का विशिष्ट अनुक्रम और संरचना इसे इम्युनोजेनेसिटी या इम्युनोरिएक्टिविटी दे सकती है, जिससे यह एंटीबॉडी, टीके या इम्यूनोडायग्नोस्टिक अभिकर्मकों की तैयारी के लिए उपयुक्त हो जाती है।
जेड-एआरजी-एलईयू-एआरजी-ग्लाइ-ग्लाइ-एएमसीएक बायोएक्टिव पेप्टाइड है जिसका उपयोग आमतौर पर बायोमेडिकल अनुसंधान और दवा विकास में किया जाता है। Z{{1}ARG-LEU-ARG-GLY-AMC को संश्लेषित करने के लिए प्रयोगशाला विधि के विस्तृत चरण और संबंधित रासायनिक समीकरण निम्नलिखित हैं:
स्टेप 1
उपयुक्त वाहक चुनें:
कैरियर पर अंतिम एएमसी समूह को ठीक करने के लिए एक उपयुक्त कैरियर (जैसे रिंक एमाइड एमबीएएचए रेजिन) का उपयोग करें।
चरण दो
पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाओं का अनुक्रमिक संश्लेषण:
Fmoc सॉलिड {{0} चरण संश्लेषण रणनीति का उपयोग करते हुए, Z {{1} ARG - LEU {{3} ARG - GLY {{5} GLY अवशेषों को क्रमिक रूप से वाहक पर AMC समूह के निश्चित छोर पर जोड़ा गया। प्रत्येक अवशेष को जोड़ने में निम्नलिखित चरण शामिल हैं:
-डिप्रोटेक्शन: एफएमओसी सुरक्षात्मक समूह को हटा दें और अमीनो एसिड के मुक्त अमीनो समूह को उजागर करें।
-युग्मन: वाहक पर सक्रिय अमीनो एसिड एस्टर और मुक्त अमीनो समूहों के बीच नए पेप्टाइड बांड का निर्माण।
चरण 3
सुरक्षात्मक आधार निकालें:
पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला का संश्लेषण पूरा होने के बाद, N-अंत पर Fmoc सुरक्षात्मक समूह को हटा दें और अंत में मुक्त अमीनो समूह को उजागर करें।
चरण 4
पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाएँ हटाएँ:
वाहक से पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला को हटा दें और साथ ही सभी साइड चेन सुरक्षात्मक समूहों को हटा दें।
चरण 5
अमीनोएसिलेशन:
संश्लेषित पेप्टाइड को डीएमएफ जैसे उपयुक्त विलायक में घोलें और कार्बामोयलेशन प्रतिक्रिया के लिए उचित मात्रा में फॉर्मामाइड (HONHCOCH3) मिलाएं। यह चरण प्रत्येक आर्गिनिन अवशेष की साइड चेन पर Z-सुरक्षात्मक समूह पेश करेगा।
चरण 6
Z सुरक्षात्मक आधार को हटाना:
आर्गिनिन अवशेषों से सुरक्षात्मक समूह को हटाने और इसकी साइड चेन पर मुक्त कणों को उजागर करने के लिए टीएफए (ट्राइफ्लूरोएसेटिक एसिड) जैसे उचित सुरक्षात्मक अभिकर्मकों का उपयोग करें।
चरण 7
अमीनोमेथिलेशन:
हटाए गए Z सुरक्षात्मक समूह के साथ पेप्टाइड को उचित विलायक में घोलें, उचित मात्रा में मेथनॉल एमाइन (MeNH2) मिलाएं, और अमीनो मिथाइलेशन प्रतिक्रिया करें। यह चरण प्रत्येक आर्गिनिन अवशेष की साइड चेन पर मिथाइलेशन पेश करेगा।
चरण 8
कच्चे उत्पादों का शुद्धिकरण:
उचित क्रोमैटोग्राफ़िक तकनीकों जैसे कि रिवर्स चरण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके, संश्लेषित पेप्टाइड्स को अशुद्धियों और अप्रयुक्त पदार्थों को हटाने के लिए कच्चे उत्पादों से शुद्ध किया जाता है।
चरण 9
शुद्धि:
उच्च शुद्धता के साथ लक्ष्य उत्पाद प्राप्त करने के लिए कच्चे उत्पाद का और अधिक शुद्धिकरण उच्च स्तर की क्रोमैटोग्राफ़िक तकनीकों जैसे रिवर्स चरण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी या कॉलम क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके किया जाता है।
चरण 10
पहचान:
शुद्ध पेप्टाइड्स की संरचना और शुद्धता की पहचान करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक (जैसे मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण) और क्रोमैटोग्राफी तकनीक (जैसे उच्च - प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी) का उपयोग करें।
Z{{0}ARG-LEU-ARG-GLY-GLY{5}AMC प्रोटीज़ का पता लगाने के लिए "स्वर्ण मानक" है
जैव रसायन और आणविक जीव विज्ञान अनुसंधान के क्षेत्र में, प्रोटीज़ गतिविधि का पता लगाना सेल सिग्नलिंग, रोग तंत्र और दवा विकास को समझने में एक मुख्य कदम है। पारंपरिक पता लगाने के तरीके, जैसे कि वर्णमिति और रेडियोलेबल तरीके, कम संवेदनशीलता, जटिल संचालन या संभावित सुरक्षा खतरों के कारण आधुनिक अनुसंधान आवश्यकताओं को पूरा करना मुश्किल हैं।Z-Arg-Leu-Arg-Gly-Gly-AMC(संक्षिप्त रूप में Z-LRGG-AMC), एक फ्लोरोसेंट लेबल वाले पेप्टाइड सब्सट्रेट के रूप में, अपनी उच्च संवेदनशीलता, विशिष्टता और वास्तविक -समय की निगरानी क्षमता के कारण प्रोटीज का पता लगाने के लिए "स्वर्ण मानक" बन गया है।
क्रिया का तंत्र: फ्लोरोसेंट संकेतों का सटीक रूपांतरण
Z-LRGG-AMC की कार्रवाई प्रक्रिया को तीन चरणों में विभाजित किया जा सकता है:
प्रोटीज़, जैसे कि SARS -CoV पपैन जैसे प्रोटीज़ PLpro, विशेष रूप से सक्रिय केंद्र में उत्प्रेरक ट्रायड (Cys His Asp) के माध्यम से सब्सट्रेट पेप्टाइड अनुक्रमों से बंधते हैं। उदाहरण के लिए, PLpro Arg{2}}X-Arg-ग्लाइ अनुक्रमों की पहचान को प्राथमिकता देता है, जहां X एक हाइड्रोफोबिक अमीनो एसिड (जैसे कि ल्यू) है।
प्रोटीज़ एएमसी फ्लोरोसेंट समूहों को जारी करते हुए, आर्ग लेउ के बीच पेप्टाइड बांड के हाइड्रोलिसिस को उत्प्रेरित करता है। काटने की प्रतिक्रिया कैनेटीक्स Mie समीकरण के अनुरूप है, और प्रतिदीप्ति तीव्रता समय के साथ रैखिक रूप से बढ़ती है, ढलान एंजाइम गतिविधि को दर्शाती है।
प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोफोटोमीटर या माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 460nm प्रतिदीप्ति उत्सर्जन तीव्रता की वास्तविक समय निगरानी। उदाहरण के लिए, SARS CoV अनुसंधान में, दाना दाढ़ स्तर पर संवेदनशीलता के साथ, Z{2}}LRGG-AMC दरार द्वारा उत्पन्न प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाकर PLpro गतिविधि का मात्रात्मक विश्लेषण किया जा सकता है।
अनुप्रयोग परिदृश्य: मल्टी डोमेन वैज्ञानिक उपकरण
वायरल प्रोटीज़ पर शोध: एंटी कोरोनोवायरस दवाओं के विकास के लिए एक मुख्य उपकरण
पीएलप्रो वायरस पॉलीप्रोटीन प्रसंस्करण और मेजबान प्रतिरक्षा से बचने के लिए जिम्मेदार है, और एंटीवायरल दवाओं के लिए एक प्रमुख लक्ष्य है। PLpro विशिष्ट सब्सट्रेट के रूप में Z-LRGG-AMC की क्लीवेज दक्षता पारंपरिक सब्सट्रेट्स जैसे Z-Gly-Gly Arg AMC की तुलना में तीन गुना अधिक है। दवा स्क्रीनिंग में, Z{6}}LRGG-AMC के पीएलप्रो क्लीवेज पर यौगिकों की निषेध दर का पता लगाकर संभावित एंटीवायरल दवाओं की तुरंत पहचान की जा सकती है।
For example, a study used this substrate to screen candidate molecules with inhibition rate>100000 यौगिकों की लाइब्रेरी से 90%, रेमेडिसविर जैसी एंटीवायरल दवाओं के विकास के लिए महत्वपूर्ण सहायता प्रदान करता है। Z-LRGG-AMC पर विभिन्न वायरस स्ट्रेन PLpro की काटने की दक्षता की तुलना करके, प्रोटीज़ गतिविधि पर वायरस भिन्नता के प्रभाव को प्रकट किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, SARS-CoV-PLpro की तुलना में SARS-CoV-PLpro की तुलना में SARS-CoV-8-2 PLpro की काटने की दर 1.5 गुना तेज है, जिससे पता चलता है कि इसमें मजबूत मेजबान प्रतिरक्षा नियामक क्षमता हो सकती है।
यूबिकिटिनेज़ पर शोध: प्रोटीन क्षरण विनियमन के लिए जांच
IPaseT और अन्य DUB, यूबिकिटिन के C-टर्मिनल अनुक्रम को तोड़कर प्रोटीन क्षरण को नियंत्रित करते हैं। Z{2}}LRGG-AMC 18 M ⁻¹ s ⁻¹ के kcat/Km मान के साथ, ubiquitin की C-टर्मिनल संरचना का अनुकरण करता है, जो इसे DUB कैनेटीक्स के अध्ययन के लिए एक आदर्श सब्सट्रेट बनाता है। उदाहरण के लिए, कैंसर अनुसंधान में, प्रोटीन होमियोस्टैसिस असंतुलन और ट्यूमर की प्रगति के बीच संबंध का मूल्यांकन ट्यूमर कोशिकाओं में Z{7}}LRGG-AMC पर DUB की दरार गतिविधि का पता लगाकर किया जा सकता है।
प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरईटी) तकनीक के साथ संयुक्त, जेड {{0}एलआरजीजी {{1}एएमसी का उपयोग इंट्रासेल्युलर सर्वव्यापी संशोधन प्रक्रियाओं की वास्तविक समय ट्रैकिंग के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग मॉडल में, अल्फा सिन्यूक्लिन सर्वव्यापीकरण के स्तर का पता लगाने से इसके एकत्रीकरण और प्रोटीसोम डिसफंक्शन के बीच संबंध का पता चलता है।
उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग: नई दवा के विकास में तेजी लाना
384 वेल प्लेट में, Z-LRGG-AMC को परीक्षण यौगिक के साथ मिलाया गया था और एंजाइम अवरोधकों को प्रतिदीप्ति संकेत परिवर्तनों द्वारा तेजी से जांचा गया था। इस विधि में उच्च थ्रूपुट (प्रति दिन हजारों यौगिकों की स्क्रीनिंग की जा सकती है) और कम लागत (एकल छिद्र लागत) है<0.1 USD), and has become a standard process for drug development. By changing the substrate concentration, the Km (Michaelis constant) and Vmax (maximum reaction rate) of the enzyme on Z-LRGG-AMC were determined, providing a theoretical basis for inhibitor design. For example, a study used this substrate to determine a Km value of 12 μ M for PLpro, providing key data for optimizing inhibitor affinity.
अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्नों
क्या यह डीएमएसओ में पूरी तरह से घुल गया है या ऐसा लगता है कि यह घुल रहा है? --एक घोटाला जो नंगी आंखों से अदृश्य है
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यह डीएमएसओ में "भेस का मास्टर" है - जब पहली बार घुल जाता है तो स्पष्ट होता है, लेकिन पानी की थोड़ी मात्रा के प्रेरण के तहत, यह धीरे-धीरे नैनोस्केल अवक्षेपित करता है जो नग्न आंखों के लिए पूरी तरह से अपरिचित होता है। यद्यपि घुलनशीलता डेटा 'डीएमएसओ में घुलनशील' बताता है, पेप्टाइड सब्सट्रेट डीएमएसओ में पानी की अवशिष्ट मात्रा के प्रति अत्यधिक संवेदनशील होते हैं। सच्चा ठंडा ज्ञान यह है कि इसका सबसे उपयुक्त विलायक डीएमएसओ नहीं है, बल्कि 10% एसिटिक एसिड समाधान है। यह मुख्य जानकारी नियमित उत्पाद पृष्ठों पर शायद ही कभी दिखाई देती है, और "परिणामों की खराब प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता" और "सिग्नल ड्रिफ्ट" की समस्याओं को हल करने के लिए एक "ट्रिक" है।
यह प्रकाश से नहीं, बल्कि "ठंड" के दौरान शारीरिक क्षति से डरता है? --एएमसी समूहों की विशेष "दर्द अनुभूति"।
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बार-बार जमना और पिघलना इसके लिए "शारीरिक यातना" के बराबर है, भले ही यह ख़राब न हो, एकत्रित अणु सब्सट्रेट गतिविधि खो देंगे। यद्यपि एएमसी समूह स्वयं प्रकाश के प्रति प्रतिरोधी है, बार-बार जमने के चक्र के दौरान बर्फ के क्रिस्टल के संपीड़न के कारण पेप्टाइड अपरिवर्तनीय एकत्रीकरण के लिए अतिसंवेदनशील है। उद्योग मानक अनुशंसा: घोल को 6 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर और केवल 1 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। एक बार पिघलने के बाद, शेष मूल शराब को तुरंत पैक किया जाना चाहिए या त्याग दिया जाना चाहिए। आपको जिस सिग्नल की अचानक कमी का सामना करना पड़ा, वह संभवतः फ़्रीज़-पिघलना चक्रों के कारण होने वाली "झूठी मौत" की घटना के कारण है।
Z-Leu-Arg Gly Gly AMC का "जैविक पुत्र" कौन है?
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Z-LRGG-AMC (टेट्रापेप्टाइड) ubiquitinase के लिए "सार्वभौमिक सब्सट्रेट" है, जबकि Z-RLRGG-AMC (पेंटापेप्टाइड) हेटेरोपेप्टिडेज़ T और SARS वायरस PLpro के लिए "विशेष कुंजी" है।
हालाँकि दोनों को आमतौर पर "यूबिकिटिन एंजाइम सब्सट्रेट्स" के रूप में जाना जाता है, लेकिन वे अत्यधिक भिन्न हैं:
Z-LRGG-AMC: यूबिकिटिन के C-टर्मिनस का अनुकरण करता है और इसका उपयोग मुख्य रूप से UCH परिवार (जैसे UCH{3}}L3) की सार्वभौमिक पहचान के लिए किया जाता है।
Z-RLRGG-AMC: एक अतिरिक्त Arg जोड़ा गया है, जिससे यह ड्यूबिकिटिनेज़ USP5 और SARS कोरोना वायरस PLpro के लिए एक विशिष्ट पसंदीदा सब्सट्रेट बन गया है।
डीटीटी (डाइथियोथेरिटोल) को प्रतिक्रिया बफर में क्यों जोड़ना पड़ता है? --सक्रिय सिस्टीन का 'रासायनिक जीवन रक्षक प्रतीक'
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यदि पर्याप्त मात्रा में कम करने वाले एजेंट (जैसे डीटीटी) नहीं मिलाया जाता है, तो इसकी दरार वाली जगह कुछ ही मिनटों में "जंग" लग जाएगी, जिससे सब्सट्रेट "मृत पदार्थ" में बदल जाएगा।
इसका हाइड्रोलिसिस एंजाइम सक्रिय केंद्र में मुक्त सिस्टीन (Cys) पर निर्भर करता है। थायोल समूह हवा द्वारा आसानी से ऑक्सीकृत होकर डाइसल्फ़ाइड बांड (- S-S -) बनाता है, जिससे एंजाइम निष्क्रिय हो जाता है। मानक प्रतिक्रिया प्रणाली (जैसे HEPES बफर, pH 7.4) में 1-5 mM DTT होना चाहिए। इस 'अलिखित नियम' का उल्लेख अक्सर केवल छोटे अक्षर एनोटेशन या पद्धति संबंधी विवरणों में किया जाता है, और यह सबसे आम अपराधी है जो नौसिखिया प्रयोगों के एंजाइमों को निष्क्रिय कर देता है, चाहे उन्हें कितना भी जोड़ा जाए।
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